Строительные исследования
страница - 0
Влияние структуры на взаимодействие липополисахарида с порином наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis
Вакорина Т.И. ( vakorina@piboc.dvo.ru ) (1), Новикова О.Д. (1), Красикова И.Н. (1), Набережных Г.А. (1), Соловьева Т.Ф. (1), Оводов Ю.С. ( ovoys@physiol.komisc.ru ) (2)
(1)Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток, (2) Институт физиологии Коми НЦ, УрО РАН, Сыктывкар
Липополисахарид (ЛПС) и порообразующие тримерные белки (порины) являются основными компонентами наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий [1]. ЛПС - специфический амфифильный биополимер, молекула которого состоит из трех фрагментов: олигосахарида кора, липида А и О-специфических полисахаридных цепей (S-ЛПС). Молекула ЛПС, не содержащая полисахаридных цепей, определяется как R-ЛПС. Порины обеспечивают важную для микробной клетки функцию, образуя в нативной мембране гидрофильные поры, через которые диффундируют низкомолекулярные вещества, нутриенты и метаболиты жизнедеятельности клетки.
Специфическое взаимодействие ЛПС и поринов, существующее в нативной мембране, определяет свойства НМ и имеет решающее значение для жизнедеятельности бактериальной клетки. [1-3]. Так, ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК), содержащие в своем составе ЛПС и порины, являются рецепторами фагов, колицинов, участвуют в процессе конъюгации клеток. Кроме того, ЛПБК играют важную роль в сборке мембраны: только взаимодействие с ЛПС обеспечивает олигомеризацию порина, реконструкцию "зрелого" белка в НМ. Существуют экспериментальные доказательства того, что структура ЛПС и конформационное состояние порина во многом определяют как свойства изолированного комплекса, так и молекулярную организацию и стабильность НМ в целом [4]. Тем не менее, данные о стехиометрии ЛПБК и влиянии структуры ЛПС на характер и эффективность комплексообразования встречаются лишь в единичных работах [5-7]. Нуждается также в определении и уточнении механизм образования комплексов и количественные характеристики этого процесса.
Выяснение механизмов взаимодействия биологически активных макромолекул, являющихся компонентами живых биологических систем, остается одним из основных направлений современных исследований. С разработкой новых поколений вычислительной техники и новых вычислительных технологий для решения задач такого рода все более эффективными становятся методы математического моделирования
структуры и динамических свойств различных биомолекул. Однако развитие представлений о пространственной организации и механизмах функционирования таких сложных мультифункциональных макромолекул, как мембранные белки и ЛПС бактерий, невозможно без корреляции результатов, полученных с помощью теоретических моделей, с экспериментальными данными о физико-химических свойствах молекул. В связи с этим, не теряют своей актуальности подходы, позволяющие проанализировать изменения биологичекой активности или характера взаимодействия биомолекул с изменением их структуры.
Настоящая работа является частью систематического исследования [8-10] взаимодействия различных молекулярных форм (тримерной и мономерной) порообразующего белка НМ Yersinia pseudotuberculosis с эндогенным ЛПС и его структурными фрагментами. Работа, посвящена изучению взаимодействия тримера порина с эндогенными ЛПС методом тушения собственной флуоресценции белка. Ее целью явилось изучение влияния структуры ЛПС, а именно длины О-специфических полисахаридных цепей и степени ацилирования липида А (остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты) на характер, эффективность и количественные параметры комплексообразования.
Экспериментальная часть
Выделение и очистка порина Иерсинин в олигомерной форме получали, как описано ранее [11] с последующей гель-хроматографией на TSK-геле (Toysoda, Япония) [12]. Степень очистки порина от сопутствующих белков определяли с помощью SDS, ПААГ-электрофореза по Лэммли [13]. Белки, разделенные в геле, окрашивали раствором Кумасси ярко-голубого G-250 в 3,5%-ной хлорной кислоте [14]. Содержание белка определяли по модифицированному методу Лоури в присутствии 2%-ного додецилсульфата натрия (SDS) [15], моносахариды - стандартным методом [16]. Полученный препарат иерсинина содержит 75-80% белка и не более 5% моносахаридов.
Для очистки от ЛПС образец белка выдерживали 16 часов при 37°С в буфере, содержащем 1мМ ЭДТА, 20мМ Tris-HCl, pH 7,5 (буфер А) и 0,5% дезоксихолата натрия (ДОХ), затем фракционировали на колонке с сефадексом G-200 в буфере А, содержащем 0,25% ДОХ. Содержание ЛПС во фракциях контролировали с помощью теста с тиобарбитуровой кислотой [17] и SDS, ПААГ-электрофореза, проявляя гели ионами серебра [18].
Выделение и очистка ЛПС. В экспериментах использовали штаммы Y. pseudotubercuiosis IB серовара, выращенные при 8° и 37°С на жидкой питательной среде [19]. ЛПС получали последовательной экстракцией бактерий смесью фенол-хлороформ-
петролейный эфир (2:5:8) [20] и горячим водным фенолом по методу Вестфаля и сотр. [21]. Определение общего содержания углеводов, белка и нуклеиновых кислот проводили, как описано ранее [19]. Количественный анализ моносахаридов в виде ацетатов полиолов проводили методом ГЖХ, используя ксилозу в качестве внутреннего стандарта [19]. Степень полимеризации (n) ЛПС рассчитывали, определяя мольное отношение маннозы (моносахарида О-специфического полисахарида IB серовара [22]) и гептозы (моносахарида кора [23]) в гидролизатах ЛПС (1М трифторуксусная кислота, 100°С, 2 часа). Жирные кислоты получали гидролизом ЛПС 4М NaOH (100°С, 4 часа) и анализировали в виде метиловых эфиров (обработка диазометаном) с помощью ГЖХ и ГЖХ-МС, используя тетрадекановую кислоту в качестве стандарта [24]. Степень ацилирования 3-гидрокситетрадекановой кислоты определяли как отношение додекановой и 3-гидрокситетрадекановой (100%) кислот [25].
Флуоресценция. Спектры флуоресценции белка измеряли на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония) при 25оС в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см. Возбуждение флуоресценции проводили при 280 нм. Спектры флуоресценции, скорректированные по родамину В (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буфера. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения составляла 5 нм.
Эксперимент проводили следующим образом: при 24° С к 1мл раствора порина (с = 5,4-10-7М) при интенсивном перемешивании добавляли равные порции (20 мкл) соответствующего ЛПС (с = 4,2-10-4М) и через 20-30 минут (достижение равновесия) измеряли спектры флуоресценции белка. При образовании ЛПБК происходило уменьшение интенсивности флуоресценции порина до предельной величины, которую контролировали .при max, равной 327 нм. Значение интенсивности флуоресценции белка, при котором не происходило уменьшения при добавлении лиганда, принимали за FOT. Степень насыщения мест связывания на молекуле порина (9) определяли по изменению интенсивности флуоресценции белка: 9 = (Fo - FXFo - F„) = AF/AFmax,
где Fo и F - исходная интенсивность флуоресценции белка при 327 нм и интенсивность флуоресценции раствора белка при этой же длине волны после добавления ЛПС, AFmax -максимальное падение флуоресценции. Все значения интенсивности флуоресценции (F) были скорректированы с учетом разбавления раствора порина при добавлении ЛПС и внутреннего фильтра [26].
По данным проведенного эксперимента строили графики в координатах Скэтчарда: 9/[ЛПС]общ.. от 9, где 9 - степень насыщения, [ЛПС]общ. - общая концентрация
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2] [стр.3] [стр.4] [стр.5]