Строительные исследования
страница - 0
Изучение пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии индолил-3-уксусной кислоты
Рогожин В.В. (vrogozhin@mail.ru), Рогожина Т.В. Якутская государственная сельскохозяйственная академия
Пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7) катализирует реакции окисления неорганических и органических соединений перекисью водорода [1]. Субстраты пероксидазы можно условно разделить на две группы - быстро и медленно окисляемые. Последние из них являются соединениями, относящиеся к донорам электронов. Среди этой группы следует выделить вещества, обладающие высокой функциональной активностью в растениях (НАДН, индолил-3-уксусная кислота (ИУК), аскорбиновая кислота (АК)). Пероксидаза катализирует окисление индолил-3-уксусной кислоты как в присутствии, так и в отсутствие перекиси водорода [2-4]. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола [5,6]. Предложено, что пероксидаза способна одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК. Высказывается предположение, что на поверхности белка существует центр специфического связывания ауксина, отличающийся от активного центра, расщепляющего перекись водорода или органическую гидроперекись [6]. С помощью компьютерных методов показано, что пероксидазы растений и ауксин-связывающие белки содержат участки сходной структуры. При этом эти участки формируют основную часть дистального домена пероксидаз растений, и один из них непосредственно соответствует последовательности, координирующей гем с дистальной стороны активного центра [6]. По данным антигенного картирования пероксидазы хрена установлено, что в состав активного центра фермента входят несколько функционально важных аминокислотных остатков: Arg 38, Phe 142 и 143, которые формируют канал
доступа ароматических субстратов к активному центру пероксидазы хрена [7]. Установлен молекулярный механизм расщепления перекиси водорода в активном центре пероксидаз растений [8-9]. Показано, что в катализе фермента участвуют железо (III) протопорфирина IX и два дистальных аминокислотных остатков - His 42 и Arg 38. Однако до сих пор существуют сложности в предсказании субстратной специфичности пероксидазы хрена, недостаточно изучены механизмы пероксидазного окисления быстро и медленно окисляемых органических субстратов фермента. Поэтому целью данной работы было изучить участие индолил-3-уксусной кислоты в механизме пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, а также, по возможности, раскрыть закономерности этого каталитического процесса.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали пероксидазу хрена производства (<<Reanal>>, Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ=1.0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при 403 нм (s=100 мМ-1 см-1 [10]) и по пиридингемохромогену [11]. Использовали аскорбиновую кислоту и индолил-3-уксусную кислоту фирмы (<<Serva>>, Германия). Концентрацию перекиси водорода (<<Реахим>>, Россия) определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при
230 нм - 72,7 М-1 см-1 [12].
Реакцию окисления аскорбиновой кислоты (3,65-91,2 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23о в среде 0,1 М натрий-ацетатного (рН 4,5-6,0) или 0,1 М натрий-фосфатного (рН 6,0-7,5) буферов объемом 2,5 мл при концентрациях пероксидазы хрена 99-142 нМ. Окисление аскорбиновой кислоты регистрировали по уменьшению поглощения при 265 нм (s=7,0 мМ-1см-1 [13]). Ингибирование пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты индолил-3-уксусной кислотой изучали путем добавления в кювету вместе с
субстратами (при насыщающей концентрации одного из субстратов) пероксидазы ингибитора. Кинетические кривые снимали на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы (<<Varian>>, США). За единицу
активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль
аскорбиновой кислоты за 1 мин.
Кажущиеся константы скорости окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике [14].
Пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты изучено в работе [15]. Показано, что окисление АК зависит от числа молекул субстрата, взаимодействующих с окисленными формами пероксидазы. Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК ускоряется. Аналогичное предположение образования тройного промежуточного комплекса Е2 с двумя молекулами донора водорода было высказано для объяснения кинетических закономерностей пероксидазного окисления люминола и пирогаллола в стационарных условиях [16, 17]
Для объяснения механизма действия пероксидазы в реакциях окисления АК предложена схема 1 [15]: E + H2O2 -> E1
E1 + AH2 <-- E1-AH2 -> E2-AH -> E + A
Е, Е1, Е2 - нативный фермент и его окисленные формы; АН2 - аскорбиновая кислота; Е1-АН2, Е2-АН, Е2-2АН2 - комплексы одной и двух молекул аскорбиновой кислоты с промежуточными соединениями Е1 и Е2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Е2-2АН2
Схема 1
Е + 2А
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2] [стр.3] [стр.4]