Строительные исследования
страница - 0
Изучение механизма аутокаталитической активации прокатепсина H in vitro.
Васильева О.С.( olga.vassilieva@iis.si )(1,2), Серебров В.Ю.(1),
Турк Б.(2), Турк В.(2)
(1)Кафедра Биохимии и Молекулярной Биологии, Сибирский Государственный Медицинский Университет, Московский тракт 2, 634050, Томск, РФ. (2)Department of Biochemistry and Molecular Biology, J. Stefan Institute, Jamova 39, 1000
Ljubljana, Slovenia
ВВЕДЕНИЕ
Катепсин Н (EC 3.4.22.16) принадлежит к группе цистеиновых лизосомальных протеиназ, принимающих участие во множестве физиологических процессов, таких как регуляция внутриклеточного метаболизма протеинов, посттрансляционное изменение белков, клеточная дифференциация, процессы роста и старения, активация и инактивация гормонов и нейропептидов, процесс иммунного ответа и другие [24]. В настоящее время к числу наиболее актуальных направлений современной медицинской патохимии и патофизиологии относятся исследования активности цистеиновых катепсинов в плазме крови при процессах опухолевого роста. Как было показано, высокое содержание катепсина Н характерно для ряда опухолевых тканей, таких как глиобластома и анапластическая астроцитома [23], колоректальная карцинома [3] и рак груди [8]. Повышенный уровень активности фермента был обнаружен в плазме крови пациентов с раком легких [22], раком груди [8] и меланомой [12]. Было предложено использовать катепсина Н как маркер для дифференциации между онкоцитомой и гепатоцеллюлярной карциномой [23], а также в качестве прогностического маркера для пациентов с меланомой [12].
Как и все лизосомальные катепсины, катепсин Н, синтезируются рибосомами в виде препроэнзима. После прохождения через эндоплазматический ретикулум препетид отделяется и прокатепсин подвергается протеолитическому превращению в активную, зрелую форму
фермента в кислотной среде поздних эндосом или в лизосомах [10]. Лимитированный протеолиз, таким образом, является критическим этапом для контроля протеолитической активности катепсинов и ряда других протеаз [17]. Было установлено, что протеолитическое отщепление пропептида достигается действием различных протеаз, таких как пепсин, нейтрофильная эластаза, катепсин D, а также различными цистеиновыми протеиназами [20]. В последние годы, большинство исследований сконцентрировалось на изучении аутокаталитического процессинга лизосомальных протеаз в кислотной среде, так как снижение рН, предположительно, ослабляет взаимодействие между пропептидом и каталитической частью молекулы, что было показано на примере взаимодействия катепсинов В и L с их пропетидами [6, 24]. Как следствие, профермент, вероятно, претерпевает конформационные изменения в результате которых связь пропептида с активным центром ослабляется при сохранной вторичной структуре [21]. Так же одним из механизмов данного процесса может являться расширение места активного центра за счет изменения рН, что было показано для зрелого папаина, смещения пропептида окклюзионной петлёй, как это уже было предложено для катепсина В, и/или небольшими локальными структурными изменениями в пропептиде, что имеет место у катепсина L [24]. Инициация цепной реакции отщепления пропетида, тем не менее, остаётся интригующей частью всего процесса. Следует отметить, что процесс аутоактивации катепсинов В и L значительно ускоряется в присутствии различных гликозаминогликанов вплоть до рН 6.0 [21, 9]. Так как гликозаминогликаны (мукополисахариды) в процессе метаболизма сосредотачиваются в лизосомах [26], они могут быть вовлечены в процессинг цистеиновых протеиназ in vivo за счет ослабления взаимодействий между пропептидом и каталитической частью молекулы.
В данной работе нами был выделен рекомбинантный человеческий прокатепсин Н, который был експрессирован в Escherichia coli, с последующей аутокаталитической активацией его в зрелый фермент с исследованием этого процесса при различных условиях. Таким образом, настоящее исследование вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о процессе активации прокатепсина Н и способствует пониманию роли данного фермента в развитии ряда патологических состояний.
МЕТОДЫ
ПЦР-амплификация и клонирование. ДНК кодирующая прокатепсин Н была ПЦР-амплифицирована на основе клона ДНК человеческого эндометрия матки и перенесена в вектор
экспрессии pET3a. Полученная рекомбинантная плазмида (pBMF2) была трансформирована со штаммом E. coli BL21[DE3]pLysS [5]. Нуклеотидная последовательность была определена с помощью капилярного электрофореза на АВ! 310 секвенаторе (Applied Biosystems, США), с использованием BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit. Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты были получены из Boehringer Mannheim, New England BioLabs и Pharmacia.
Экспрессия и выделение телец включения. Трансформированный штамм E. coli BL21[DE3]pLysS с pBMF2 был инкубирован при 37°C в 4 мл Luria-Bertrani medium содержащим 100 мг/л ампицилина и 50 мг/л хлорамфениколя с индукцией выработки рекомбинантного прокатепсина Н добавлением ИПТГ (изопропил тио-в-Д-галактопиранозид), после достижения абсорбции 0.7-1.0 при длине волны 600 нм. Дальнейшее растворение и сульфонирование телец включения с 2 мл 50 мМ 2-нитро-5-тиосульфобензоатом было проведено соответственно стандартному протоколу [11].
Очистка, конформационное свертывание и активация прокатепсина H. Для очистки фермента использовали метод гельфильтрации, для чего растворенные белки были нанесены на Sephacryl S-200 колонку (140 см x 2.15 см) и элюированы с исходным буфером (3.5 M GdmHCl, 20 мМ ТрисНО, pH 8.0, 3 мМ ЭДТА). После гельфильтрации, белки фракций главного пика были подвергнуты конформационному свертыванию (O.S. Vassilieva, et al., in preparation) и сконцентрированны с помощью ультрофильтрации (Amicon).
Ферментный анализ. Концентрация белка была определена на основе данных УВ абсорбции с использованием Perkin Elmer Х-18 спектрометра (США) и молярного абсорбционного коэффициента рассчитанного на основе аминокислотной последовательности
[17].
Аутокаталитический процессинг прокатепсина H был достигнут подкислением среды, раствора фермента 1 M Na-ацетатным буфером, pH 4.0 до pH 5.0 и инкубацией при 37 °C с 2.5 мМ ДТТ. Активность образца была определена путем добавления 5 мкл раствора фермента к 2.5 мл 10 мкM раствора субстрата Bz-Phe-Val-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (AMC) (Bachem, Швейцария) в 0.1 М фосфатном буфере, pH 6.5, содержащем 1 мМ ЭДТА, 0.1% полиэтилен гликоля 6000. Флюоресценция образующегося продукта контролировалась в течении 1 мин с помощью Perkin Elmer LS-50 спектрофлюориметра (США).
Кинетика аутокаталитической активации катепсина Н была изучена при использовании буферов с различными рН (0.1 М ацетатный буфер рН 4.0 - 5.0; 0.1 М фосфатный буфер рН 6.0-
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2] [стр.3]