Строительные исследования
страница - 0
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТИ СТЕКЛОВОЛОКОН И УГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Понаморева О.Н.(olga@tsu.tula.ru) (1), Мазанова А.А.(3), Каленюк А. А.(2), Алферов В.А.(chem.@tsu.tula.ru) (1), Решетилов.А.Н (anatol@ibpm.serpukhov.su) (3)
(1) Тульский государственный университет
(2)Институт сорбции и проблем эндоэкологии НАН Украины
(3)Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
Иммобилизованный биологический материал наряду с его широким использованием в биореакторах (производство физиологически активных веществ, трансформация органических соединений, очистка водных и газовых сред) сравнительно недавно нашел еще одно эффективное применение в аналитических приборах нового поколения - биосенсорах. Успехи этой стремительно развивающейся области аналитической биотехнологии отражены в ряде обзоров и монографий [1-5]. Одной из достаточно острых в биосенсорном анализе является проблема специфичности.
Субстратная специфичность биосенсоров каталитического типа (ферментных, клеточных, тканевых) относится к наиболее важному параметру, определяющему их практическую полезность. Специфичность (или селективность детекции) может значительно варьировать в зависимости от типа биоматериала, конструкции сенсора, метода иммобилизации и в действительности невозможно получить "абсолютную специфичность", подразумевающую чувствительность анализатора исключительно к целевому соединению.
Несмотря на то, что проблема неспецифичности анализа относится не только к сенсорам каталитического, но и аффинного типа [6], ее острота наиболее выражена для каталитических, в первую очередь, микробных сенсоров. Это обусловлено присутствием в клетках множества ферментов, приводящих к отклику биосенсора на широкий спектр окисляемых ими субстратов [6-9].
Новые тенденции, появившиеся в области создания биосенсорных анализаторов, позволяют в некоторых случаях рассматривать широкую субстратную специфичность или неселективность как преимущество и возможность ее использования для создания анализаторов многокомпонентных сред типа "искусственный нос", "искусственный язык" [10-11]. Для реализации таких систем полезными являются методы направленного изменения субстратной специфичности для получения предпочтительной чувствительности к определенному субстрату.
Ранее в работах [12-14] были представлены данные о чувствительности двух типов микробных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans (G. oxydans) к глюкозе и этиловому спирту; в силу того, что модели
сенсоров были различны, чувствительность к субстратам также различалась, что, в сущности, отражало субстратную специфичность сенсоров. Так, в соответствии с опубликованными в [12, 13] данными активность клеток, сорбированных на мембранный носитель, была выше при окислении этанола в сравнении с интенсивностью окисления глюкозы. Использование этого же штамма бактерий в электроде медиаторного типа, в котором клетки были иммобилизованы на частицах графитового порошка, содержащих сорбированный медиатор 1,1-диметилферроцен, приводило к инверсии чувствительности - интенсивность окисления глюкозы превышала интенсивность окисления этанола [14]. Причина наблюдаемого эффекта авторами указанных публикаций не исследовалась. Вместе с тем описанное изменение свойств биологического рецептора представляется важным и может составить основу для направленного изменения субстратной специфичности. Можно предположить, что основой изменений специфичности при переходе от биосенсора на основе электрода Кларка к электроду медиаторного типа может являться изменение условий иммобилизации либо способ регистрации сигнала (прямая амперометрия) наряду с присутствием дополнительного компонента биорецептора диметилферроцена.
Для выяснения причины изменения специфичности была выполнена данная работа, цель которой состояла в изучении влияния компонентов ме-диаторного электрода (графитового материала, парафинового масла, медиатора) на изменение биохимического поведения бактерий G.oxydans. Полученная информация об изменении субстратной специфичности микробных клеток может быть полезна для понимания функционирования мембраннос-вязанных ферментов в интактных клетках и в условиях электрокаталитического окисления субстратов, а также использована практически в различных биотехнологических циклах.
2. Экспериментальная часть
2.1.Материалы и методы
В работе был использован штамм Gluconobacter oxydans № 9.7 из рабочей коллекции лаборатории. Бактерии выращивали по методу, описанному в [15]. В ходе исследований применяли графитовую пудру, парафиновое масло и медиатор 1,1-диметилферроцен (Fluka). Также были использованы модифицированные углеродные материалы в виде войлока, жгута или ткани [16]. Модификацию углеродных материалов проводили по общепринятым методикам, заключающимся в жидкофазной обработке окисляющими агентами [17, 18].
При измерении сигналов сенсора в качестве электролита использовали 10 мМ калий-фосфатный буферный раствор, pH 6.5. В качестве модельных субстратов были выбраны глюкоза и этанол.
2.2.Формирование электродов и проведение измерений
Графитовые пастовые электроды готовили следующим образом. Гра-фитово-масляной пастой (100 мг графитовой пудры, смешанной с 50 мкл па-
рафинового масла) заполняли пластиковый шприц (объем 1.0 мл, внешний и внутренний диаметр диаметры выходного отверстия составляли 4.0 и 1.7 мм, соответственно). Выходное отверстие заполняли на глубину 1 мм модифицированной пастой, приготовленной растиранием в агатовой ступке 100 мг графитовой пудры, 50 мкл парафинового масла и 2.0 мг 1,1 диметилферроцена, использованного в качестве медиатора.
Медиаторный электрод, модифицированный клетками, погружали в кювету (2 мл) с тщательно перемешиваемым раствором. Ответы сенсора на вводимые в раствор концентрации субстратов регистрировали при 250 мВ относительно Ag/AgCl электрода сравнения. В случае использования модифицированных углеродных материалов последние пропитывались ацетоновым раствором медиатора (10 М). Клетки микроорганизмов иммобилизовали сорбцией, для чего на поверхность пасты, заполняющей шприц, или углеродных материалов наносили 3 мкл клеточной суспензии (100 мг сырого веса/мл), смешанной с графитовой пудрой, и подсушивали в течение 15-20 мин при комнатной температуре.
При регистрации клеточного дыхания с помощью кислородного электрода типа Кларка (оценка контрольного состояния бактерий) клетки микроорганизмов наносили на рабочую поверхность электрода (3 мкл клеточной суспензии, 50 мг сырого веса/мл), подсушивали в течение 30 мин и фиксировали с помощью капроновой сетки. Измерения проводили при полном насыщении буфера кислородом воздуха в кювете объемом 5 мл. Концентрация субстратов во всех случаях, если не указано дополнительно, составляла 5 мМ.
3. Результаты и обсуждение
В качестве контрольных значений были выбраны сигналы сенсора на основе кислородного электрода с иммобилизованными сорбцией нативными клетками микроорганизмов. Полученный ответ сенсора на этанол в 2 раза превышал ответ на глюкозу (соотношение ответов на этанол и глюкозу составляет 2:1, соответственно).
Следующий этап исследования был направлен на оценку соотношений сигналов сенсора, содержащего рецепторный элемент, представленный бактериями, удерживаемыми силами физической сорбции на мембранном носителе. Для иммобилизации использовали хроматографическую бумагу GF/A, изготовленную из стекловолокон; возможность ее применения для иммобилизации бактерий представлена в работах [12, 13]. Соотношение сигналов на этанол и глюкозу при иммобилизации клеток на мембрану GF/A незначительно изменялось (снижалось) и составляло 1.5:1 (рис.1).
Дальнейшее этапы были посвящены оценке влияния компонент медиа-торного электрода на субстратную специфичность сенсора; при этом регистрацию активности клеток производили, как и в предыдущих случаях, кислородным электродом. Рассматривали следующие варианты формирования биологического рецепторного элемента на поверхности электрода: 1) сорбция медиатора из ацетонового раствора на рабочую поверхность электрода с последующей иммобилизацией клеток на поверхности электрода;
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2] [стр.3]