Строительные исследования
страница - 0
Клетка как химический реактор: аррениусовская зависимость ДМСО-индуцируемой кинетики гибели инфузории Spirostomum ambigua от
температуры
Ковалева А.А. (1), Плетенева Т.В. (1), Серегина О.Б. (2), Сыроешкин А.В. (livmatter@mail.ru) (3)
(1)Российский Университет Дружбы Народов, медицинский факультет, (2)ГНИИ "Биоэффект", (З)Учебно-исследовательский центр "Живое вещество"
Обнаружено, что зависимость частоты процесса лиганд-индуцируемой гибели инфузории S. ambigua от температуры линеаризуется в аррениусовских координатах [Сыроешкин А.В. и др., 2001]. Оказалось, что измеряемая величина энергии активации ДМСО (диметилсульфоксид)-индуцируемой гибели является кажущейся, так как зависит от концентрации. Было обнаружено, что использование представлений о живой клетке как мультиферментном многофазном химическом реакторе позволяет описать взаимодействие S. ambigua с ДМСО как по механизму кооперативности Хилла, так и при применении уравнения изотермы адсорбции Фрейндлиха. По условиям линеаризации зависимостей времени жизни клетки от концентрации ДМСО при различных значениях температуры определен показатель степени n=9 при концентрации ДМСО в кинетическом уравнении, описывающем кинетику ДМСО-индуцируемой гибели. Определены истинные значения условной энергии активации процесса ДМСО-индуцируемой гибели S. ambigua. (Ea составила 200 кДж/моль).
Введение
Для описания кинетики развития клеточных популяции под действием ингибиторов и промоторов, при культивировании в ферментерах, при развитии раковых опухолей [1-4] успешно используется аппарат химической кинетики. С нашей точки зрения основа удачного применения квазихимических моделей состоит в адекватности представлений клетки как полиферментного химического реактора. В соответствии с этим деление клетки или ее
гибель есть интегральное отражение усиления или прекращения тех или иных ферментативных химических процессов. В предыдущей работе (Сыроешкин А.В. и др. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений, 2001. Исследовано в России) мы обосновали возможность такого подхода, как теоретически, так и при исследовании кинетики гибели инфузорий. Для инфузории S. ambigua обнаружено образование в процессе лиганд-индуцируемой гибели промежуточного состояния, эквивалентного комплексу фермента с субстратами/продуктами реакции, а также выявлена значительная зависимость кинетики гибели от температуры. В настоящей работе мы предприняли дальнейшее изучения кинетики лиганд-индуцируемой клеточной гибели S. ambigua для решения двух задач. Первая задача заключалась в поиске универсального физико-химического параметра, характеризующего ответа одноклеточной тест-модели на воздействие токсических соединений. В качестве таких параметров могут использованы энергия активации и предэкспоненциальный множитель в уравнении Аррениуса. Для этой задачи оптимально использование S. ambigua, который широко применяется как тест культура для токикологических и фармакологических исследований [5-9]. Вторая задача заключалась в дальнейшем развитии представлений о клетке, как квазихимическом полиферментном реакторе. В качестве лиганда, обладающего биологической активностью был выбран ДМСО (диметилсульфоксид). ДМСО как токсический агент действует по многим механизмам, влияя на все ферментные системы клетки и как лиганд, и как модификатор водных растворов и мембран микрофаз, изменяющий их вязкость и диэлектрическую проницаемость. Таким образом, выявление механизма действия ДМСО на клетку в целом с использованием аппарата химической кинетики является многоплановой задачей при оценке интегральной токсичности.
Методы
Spirostomum ambigua O.F.MUller, 1786 (использовался штамм проф. Леонидова, ГНИИ "Биоэффект") - одна из наиболее широко распространённых спиральноресничных инфузорий (Spirostomidae, Heterotricha, Ciliophora), классический объект исследований в биологии клетки и при биоиндикации. В природных условиях сапротроф-детритофаг, часто обнаруживается в сильно загрязнённых и крайне микроанаэробных точках. Имеет лентовидную, несколько дорзо-вентрально уплощенную форму тела, около 1 мм длиной, соотношение длины тела к его ширине примерно 1 : 1 0, макронуклеус четковидный, ротовой аппарат доходит до задней трети тела. Будучи потревоженным, клетка даёт мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2-3 раза. Параметры сокращения зависят от температуры
[10]. Используемый штамм культивировали при концентрации 30-50 клеток/мл при температуре 20-24 оС. Штамм характеризовался высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении.
Установка для исследования температурной зависимости кинетики гибели состояла из следующих частей. 96-луночный планшет для иммуноферменьного анализа был размещен на твердотельном термостате фирмы "Биоком" (Москва). Контроль за стационарным значением температуры и однородностью нагрева по всей площади планшета осуществлялся с помощью безинерционного четырехканального электротермометра Т4К производства НПФ "ДНК-Технология" (Москва). Наблюдение за поведением инфузории вели визуально, либо с помощью бинокуляра, либо с помощью видеоприставки к бинокуляру (Фонд биологических исследований, Москва), соединенной с монитором. Для освещения использовали маломощные лампы (~ 1 0 Вт) дневного света.
В каждую из лунок планшета вносили по 300 мкл раствора ДМСО или дистиллированной воды. Далее в каждую из лунок отсаживали (без барбатирования) по одной инфузории S. ambigua стеклянной пипеткой с диаметром носика более 1 мм. Время жизни клетки рассчитывали как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатировали, либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием сократительной реакции на механическое раздражение. Для каждой концентрации токсиканта время жизни (tl) как среднее из 4-7 измерений. Относительная ошибка измерения времени жизни не превышала 1 6%. Для контроля дрейфа, температуру раствора рассчитывали как среднее между значениями на момент посадки инфузории в лунку планшета и на момент гибели по данным 2 датчиков электротермометра. Относительная ошибка измерения температуры не превышала 8%. На всем использованном интервале температур и времени инкубации не было отмечено ни гибели, ни угнетения активности, ни морфологических изменений клеток штамма в дистиллированной воде.
Результаты и их обсуждение
В предыдущей работе (Сыроешкин А.В. и др. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений, 2001. Исследовано в России) нами была показана аррениусовская зависимость кинетики гибели S.ambigua от температуры при действии 10% ДМСО. Оказалось, что линейный характер зависимости ln(zL) от (1/T) сохраняется и при других значениях концентрации ДМСО (рис. 1). Однако Ea является функциейконцентрациитоксиканта(табл.1).
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2] [стр.3]