Строительные исследования
страница - 0
Физиологическая оценка активации Т-клеток
С.В.Родионов (rod06@mail.ru) (1), М.В.Глушков (gmv@smp.gpi.ru) (2)
(1)Институт иммунологии МЗ РФ, (2)Институт общей физики РАН
Функционирование иммунной системы сопровождается активацией Т-лимфоцитов. Часть из них (определенные Т-клеточные клоны) находится в покое, что существенно отличается от состояния активации, которое возникает после взаимодействия Т-лимфоцита с антигеном. Деление Т-лимфоцитов сопровождается синтезом целого ряда молекул, отсутствующих в покоящихся клетках. Далее, лимфоцит функционирует за счет наработанного запаса молекул, причем наблюдается транспорт из внутриклеточных депо на поверхность клетки, потеря молекул во внеклеточную среду, и деградация молекул в самом лимфоците. Число молекул активации (типичными из которых являются молекулы гистосовмести-мости II класса HLA-DR) на поверхности лимфоцита с течением времени снижаются в 100-1000 раз и более, после чего Т-клетки начинают покидать лимфоидные ткани и появляются в крови [1-4]. Показано также, что однотипные молекулы активации на поверхности клетки связаны с различными структурами цитоплазматической мембраны и цитоске-лета лимфоцита. Поэтому часть молекул легко теряется Т-клеткой, а другая удерживается более прочно [5].
В настоящее время определение поверхностных молекул на Т-клетках проводят методом проточной цитофлуориметрии с применением моноклональных антител, которые связаны с флуоресциирующимии веществами и способны "высвечивать" каждую однотипную молекулу на поверхности клетки. Соответствующий прибор (проточный цитофлуо-риметр) регистрирует число молекул отдельно на каждой клетке. Результатом такого измерения является гистограмма, где каждому интервалу на оси абсцисс (число молекул) соответствует число клеток, попавшее в этот интервал (обычно это 1024 канала, Рис.1).
Рис. 1. Экспериментальная гистограмма в линейном масштабе | ||
450 §3 350 -§ ! 300 -&0 2 50 - sg 150 " § 100 -к Р 50 - 01 | ||
L | ||
1 | ||
Ишки-........ .............. ............. . | ||
1 1 1 257 513 769 1025 Номер канала (число молекул на клетке) | ||
При оценке гистограмм традиционно определяют или процент "положительных" клеток, то есть число клеток, специфически связывающих моноклональные антитела, или
среднее число молекул на клетку. Такие оценки не отражают совокупности процессов, обуславливающих сложный характер гистограммы.
При анализе экспериментальных гистограмм с помощью математической модели удалось выявить два состояния HLA-DR молекул: со сравнительно слабым и сильным сродством к цитоплазматической мембране Т-клетки. Оценивались скорости потери молекул клеткой в этих состояниях. Для этого определялись большая и малая константы скорости и соответствующие им доли HLA-DR молекул. Кроме того, определялся параметр, связанный с переходом Т-клеток из лимфоидных тканей в кровь.
Материалы и методы
Из 3 мл венозной крови выделялись лейкоциты, эритроциты лизировались гипотоническим раствором. Суспензия лейкоцитов обрабатывалась биотинилированными моно-клональными антителами к антигену СD3, и ФИТЦ (флуоресцеин изоцианат) мечеными антителами к HLA-DR молекулам, а затем конъюгатом стрептоавидина и фикоэритрина. Контролем служили ФИТЦ меченые F(ab)2 к иммуноглобулинам мыши.[6] Измерения проводились на проточном цитометре FACScan, где в 1024 каналах в линейном масштабе записывалась гистограмма распределения числа Т-лимфоцитов по количеству на их поверхности HLA-DR молекул. Достаточно воспроизводимые результаты получались при просчете не менее 7000 CD3+ клеток. Для оптимизации расчетов каналы суммировались по 16, ив дальнейшем использовалась 64-интервальная шкала. Было обследовано 20 больных атопической и 11 инфекционной формами бронхиальной астмы и 1 2 здоровых доноров.
Описание математической модели
Функционирование Т-лимфоцитов сопровождается, активацией и постепенной потерей поверхностных HLA-DR молекул. В организме на отдельных Т- клетках это происходит не синхронно, что приводит к появлению лимфоцитов с сильно различающимся уровнем поверхностных молекул активации. Кроме того, гетерогенна сама цитоплазматическая мембрана и HLA-DR молекулы на одной и той же клетке могут иметь большее или меньшее сродство к поверхности Т-лимфоцита. Эти факторы вносят существенный вклад в распределение клеток на экспериментальной гистограмме. Кроме того, необходимо учесть роль миграции Т-лимфоцитов, так как их активация происходит в лимфоидных тканях, а анализируются клетки, попавшие в кровь. Известно, что Т-лимфоциты, попадая в кровоток, перераспределяются в организме. В результате между кровью и тканями устанавливается динамическое равновесие. В лимфоидных тканях число Т-лимфоцитов примерно в 1000 раз больше, чем в крови [7]. Если бы в крови был представлен весь набор Т-клеток с различным уровнем HLA-DR молекул, то гистограммы клеток из крови и из тканей были бы одинаковыми. В действительности наиболее богатые HLA-DR молекулами Т-клетки совсем не попадают в кровь. Только после значительной потери молекул Т-лимфоциты появляются в кровотоке [8]. Кроме того, во время циркуляции между кровью и тканями число клеток, находящихся в процессе потери поверхностных молекул все время уменьшается как за счет их гибели, так и повторного перехода в активное состояние.
Для построения математической модели функционирование множества Т-клеток искусственно сведено к рассмотрению усредненного Т-лимфоцита.
Для отдельной клетки простейший процесс потери молекул, находящихся в двух состояниях на цитоплазматической мембране, можно описать двумя дифференциальными уравнениями:
-Т~=~С1 A1; -Г2 = -c2 A2; A1 (А)) = 1; A2(t0) =
dtdt
где Aj(t) и (t) - число молекул на поверхности клетки, зависящее от времени, соответст-
венно с меньшим и большим сродством связывания, c1 и c2 - константы скорости потери молекул (с1>с2), t0 = 0. Полное число молекул на клетке A(t) получим, складывая решения:
A(t) = Aj(t)+ A2(t) = £7exp(-cjt) + 2exp(-c2t).
Так как A(t0)=Amax - полное число молекул на поверхности клетки к моменту t0:
k1 + k2 = Amax
A(t) = (Amax-k2)exp(-cjt) + expt);(1)
таким образом, каждая Т-клетка, теряя HLA-DR молекулы, проходит множество состояний в соответствии с функцией A(t).
Далее рассмотрим множество таких Т-клеток. Для формализации процесса допустим, что полное число Т-клеток в системе не изменяется, при этом клетки гибнут, только дойдя до нулевого уровня, а пополнение происходит за счет клеток с максимальным (начальным) уровнем молекул. Тогда, число клеток, прошедшее точку A1, за время At0 будет равно числу клеток, прошедшему через точку A2, за то же время:
dA(t1)
At = n(A2)
dA(t2)
At = const.
dtdt
Так как A(t) при t > 0 монотонная функция, то существует однозначная обратная функция t = g(A), имеющая непрерывную производную, на рассматриваемом интервале
1 - A - Amax.
~dA\-1 = dg, n( A1) = n( A2) = consf
dt J dA dg( 4) dg( A2)
dA dA
При этих условиях:
n(A) - g(A)(2)
На рис.2. показана связь между потерей поверхностных молекул отдельной клеткой во времени - A(t) (нижняя кривая) и числом клеток, попадающих в определенный канал ци-тофлуориметра (верхняя кривая).
содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2]